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    本發明關於一種富含治療關節炎活性的到手香精萃物，其係經以50%~95%醇類溶液或正相層析沖提到手香粗萃物而得。本發明同時提供一種治療關節炎之組合物，其包含此到手香精萃物。
    公开号:TW201321010A
    申请号:TW100142840
    申请日:2011-11-22
    公开日:2013-06-01
    发明作者:Feng-Nien Ko；Jen-Wei Chen；Wen-Ling Yang
    申请人:Oneness Biotech Co；
    IPC主号:A61K36-00
    专利说明:
    具抗關節炎活性的到手香萃取物
    本發明係關於一種植物萃取物；詳言之，本發明係關於一種富含抗關節炎活性之到手香精萃物。
    關節炎為最常見的自體免疫疾病，主要病徵為滑膜組織的發炎，伴隨著逐步骨頭侵蝕，形成關節組織的聯合與殘缺導致排列不齊的結果。該免疫功能的過度活躍不僅侷限於關節局部，而是一種全身性親炎症主控反應，導致體內發炎細胞與物質，如CD4+T細胞，B細胞與發炎性細胞激素過度產生，形成長期對關節組織破壞的能力。一般認為宿主受到不明外來病原性感染，導致T細胞的活化啟動了關節炎的病程，進而誘發多重反應，包含活化如單核細胞、巨噬細胞等發炎細胞，並直接刺激滑膜和內皮細胞的增殖，促進發炎性細胞激素、蛋白酶的分泌與自我抗體的生產；而發炎性細胞激素在關節炎疾病的發展扮演核心角色，其中腫瘤壞死因子(TNF-α)可透過刺激前列腺素E(prostaglandin E)，膠原酶(collagenase)生成，誘導其他親炎症分子如白細胞介素-1(interleukin-1,IL-1)與細胞白介素-6(IL-6)的分泌，腫瘤壞死因子與IL-1β可刺激matrix metalloproteinase的分泌，以及對軟骨內多種組織細胞，包括巨噬細胞，滑膜纖維細胞和破骨細胞進行直接的活化，而IL-6可進一步增加關節組織中的發炎細胞、刺激破骨細胞增生並加強IL-1的作用，由於各親炎症分子，包含細胞白介素1(IL-1β)，腫瘤壞死因子，IL-6和IL-17彼此間的串擾可導致持續性大規模的關節破壞，並抑制軟骨細胞代償性合成途徑而阻礙退化組織復原的完整性，因此現行臨床上除了傳統上免疫抑制劑與非類固醇類抗發炎治療藥物外，針對此類發炎因子或細胞進行專一性拮抗生物製劑的研發是目前的主流，如TNF-α拮抗劑與IL-6拮抗劑，可減緩或預防關節損傷及維持功能，但需以侵入性方式治療較為不便，且儘管在關節炎的治療已經取得較多的進展，然更長期的治療結果，以及針對佔較大比重的緩解期關節炎患者，仍無可充分控制的藥物，且至少一半患者對以一個生物製劑合併傳統關節炎藥物的治療組合已失去療效，因此開發方便、安全性高且有效的治療藥物是十分重要的。
    到手香(Plectranthus amboinicus(Lour.) Spreng)，別名：藿香、左手香、印度薄荷、過手香、到手香。屬唇形花科多年生草本，主要產於馬來西亞、巴西、中國和印度。其葉肥厚脆嫩，對生，廣卵形，先端純圓或銳，齒狀緣有點上捲。到手香株高約15~30公分，全株密被細毛，具強烈特殊辛香味，是一種好的中藥材，根據古籍記載，到手香有預防感冒的功效、增強身體抵抗力功能。也能降低耳朵紅腫、發炎、發熱現象。作為中藥稱可消炎、袪風、解毒，舒緩感冒發燒、扁桃腺炎、喉嚨發炎、肺炎、寒熱、頭痛、胸腹滿悶、嘔吐瀉泄、胃弱、脾虛寒等現象。對新鮮到手香汁液對於擦傷、刀傷、燒燙傷、蚊蟲咬傷、無名腫痛、疔瘡、耳朵發炎、喉嚨痛、腫毒、跌打損傷等有效。對皮膚也有相當大殺菌效果，像是脂漏性皮膚炎、濕疹、粉刺、過敏、皮膚乾裂、頭皮的毛囊炎、美白皮膚、消除疲勞、去除各種皮膚癬。
    有關到手香萃取物，中華民國專利申請案第092135016號曾揭露到手香萃取物製備方法，該方法主要包含下列步驟：(a)壓榨到手香葉片取其汁液；(b)加入醇至步驟(a)之汁液中，使最後醇濃度為70至80%，並於低溫下靜置；(c)調整步驟(b)中含醇汁液之pH值為5.0至7.0，並於低溫下靜置；(d)過濾去除步驟(c)中含醇汁液之雜質；(e)蒸餾濃縮步驟(d)中已去除雜質之含醇汁液，收集蒸餾液，並調整蒸餾液之pH值為5.0至7.0；及(f)真空過濾步驟(e)中之蒸餾液，以獲得茶褐色澄清之到手香萃取液。
    而中華民國專利申請案第093134346號則揭露到手香葉汁經水萃取後取分子量大於50 kD的到手香葉汁組份，其具有治療癌症及/或腫瘤之功效。
    中華民國專利申請案第086118191號揭露一種到手香或藿香之水性萃取物，係在90.5%乙醇，4.5%甲醇及5.0%異丙醇所組成的試劑乙醇下沖提所得的萃取物，具有預防及治療流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)之效。
    此外，中華民國專利申請案第096145943號，亦即第I335225號發明專利，則揭露一種使用與特定處理組合之固液分離法製備到手香萃取物，該到手香萃取物具有治療皮膚病症及促進傷口癒合之效，尤其可促進糖尿病患者傷口癒合。此案發明特徵在於使用固液分離(攪拌分離)與特定處理之組合，包含將吸附樹脂(如DIAION)於左手香萃取物中攪拌，且利用不同溶劑藉由分別分離步驟將左手香萃取物中的不同部分分離。
    又，中華民國專利申請案第095134243號，亦即第I320714號發明專利，則揭露一種到手香之水萃取物，其具有治療類風濕性關節炎之用途。該萃取物係以適量高極性溶劑浸泡，過濾後，再以減壓旋轉濃縮儀濃縮；以溶劑稀釋後視需要，可連續以四種溶劑極性由高至低，從高極性溶劑至低極性溶劑等分四段不同極性(分別稱之為高極性溶劑、次高極性溶劑、中極性溶劑、低極性溶劑)的溶液以管柱進行沖提分離。
    針對不同萃取方式而得到不同功效的到手香萃取物，仍有開發的空間。
    不同於相關習知技藝，本發明係關於一種富含抗關節炎活性的到手香精萃物，該精萃物之特徵在於以50%~95%的醇類溶液沖提或以正相層析萃取粗萃物而得，其與習知到手香萃取物不同，富含抗關節炎活性，可用於治療或預防關節炎。
    因此，本發明一方面提供一種富含抗關節炎活性的到手香精萃物，其特徵在於320 nm波長檢測，於45分鐘有薊黃素(Cirsmaritin)吸收峰。
    於本發明之實施例，該富含抗關節炎活性的到手香精萃物，其特徵在以50%~95%醇類溶液沖提到手香粗萃物而得，較佳為70%~95%醇類溶液沖提，尤佳為95%醇類溶液沖提。該醇類溶液為乙醇。
    於本發明之另一實施例，該富含抗關節炎活性的到手香精萃物，其特徵在以正相層析萃取粗萃物而得，以己烷(Hexane)為溶劑沖提，續以己烷/乙酸乙酯為溶劑沖提。
    另一方面，本發明提供一種製備富含抗關節炎活性的到手香精萃物之方法，其包含將到手香植株或乾燥藥材，經溶劑萃取粗萃物，再將該粗萃物進行層析分離粗萃物以50%~95%醇類溶液沖提分離出富含抗關節炎活性的精萃物。
    根據本發明之具體實施例，其中較佳以70%~95%醇類溶液沖提分離出富含抗關節炎活性的精萃物，尤以約95%醇類溶液為更佳。
    再一方面，本發明提供一種製備富含抗關節炎活性的到手香精萃物之方法，其包含將到手香植株或乾燥藥材，經溶劑萃取粗萃物，再將該粗萃物進行正相層析分離粗萃物，以己烷為溶劑沖提，續以己烷/乙酸乙酯為溶劑沖提分離出富含抗關節炎活性的精萃物。
    根據本發明之具體實施例，其中再以乙酸乙酯、乙酸乙酯/甲醇、及/或甲醇為溶劑，沖提分離出富含抗關節炎活性的精萃物。
    又一方面，本發明提供一種預防或治療關節炎之組合物或方法，其包含使用本發明富含抗關節炎活性的到手香精萃物。
    再一方面，本發明提供一種預防或治療關節炎之醫藥組合物，其包含治療有效量之本發明富含抗關節炎活性的到手香精萃物以及一種醫藥上可接受之載劑。
    又再一方面，本發明提供一種治療發炎之組合物或醫藥組合物，其包含治療有效量之本發明到手香精萃物。
    除非另有定義，此處所有使用之技術及科學名詞具有與本發明所屬技術領域中熟習此技藝者所一般性了解者相同的含意。
    本說明書所使用的冠詞「一」或「該」，除非內文另有清楚指明，係指該冠詞的一或一個以上(即，至少一個)的受體。舉例而言，「一樣本」係包括複數個此類本技術領域中熟習此技藝人士所知之樣本及其等效物。
    本說明書中所使用的「受體」乙辭是指接受處理隻動物或人類。
    本說明書所使用的「預防」乙辭係指如受體發病前預先處理可避免產生該病症。而「治療」乙辭則是指受體經處理後病症有改善之效。
    本說明書所使用的「治療有效量」乙辭是指用於治療之物質可提供治療功效之量。
    本發明提供一種富含抗關節炎活性的到手香精萃物，該精萃物之特徵在於320 nm波長檢測，於45分鐘有薊黃素(Cirsmaritin)吸收峰。其可以50%~95%的醇類溶液沖提或以正相層析萃取粗萃物而得，其與習知到手香萃取物不同，富含抗關節炎活性，可用於治療或預防關節炎。
    根據本發明，該富含抗關節炎活性的到手香精萃物，如以50%~95%乙醇溶液如應沖提分離製得，其HPLC圖於200 nm波長檢測，在滯留時間45分鐘有吸收峰；55分鐘有香芹酚(Carvacrol)吸收峰，如圖3；於320 nm波長檢測，在滯留時間39-43分鐘有8個吸收峰；45分鐘有薊黃素(Cirsmaritin)吸收峰，如圖4。
    根據本發明，該富含抗關節炎活性的到手香精萃物，如以70%~95%乙醇溶液如應沖提分離製得，其HPLC圖於200 nm波長檢測在滯留時間45分鐘有薊黃素(Cirsmaritin)吸收峰；55分鐘有香芹酚(Carvacrol)吸收峰，如圖5；於320 nm波長檢測在滯留時間45分鐘有薊黃素(Cirsmaritin)吸收峰；62分鐘有三裂鼠尾草素(Salvigenin)吸收峰，如圖6。
    根據本發明，該富含抗關節炎活性的到手香精萃物，如以正相層析法製得，其HPLC圖於200 nm波長檢測在滯留時間55分鐘有香芹酚(Carvacrol)吸收峰，如圖7；於其於320 nm波長檢測在滯留時間18-21分鐘有3個吸收峰；37-41分鐘有3個吸收峰；43-45分鐘有2個吸收峰；45分鐘有薊黃素(Cirsmaritin)吸收峰；50-54分鐘有4個吸收峰；62分鐘有三裂鼠尾草素(Salvigenin)吸收峰，如圖8。
    本發明中，利用進一步層析分離得到富含抗關節炎活性的到手香精萃物。主要係包含下列步驟：將到手香植株或乾燥藥材，經溶劑萃取得粗萃物，再將該粗萃物以50%~95%醇類溶液層析沖提分離出富含抗關節炎活性的精萃物。
    根據本發明之具體實施例，其中較佳以70%~95%醇類溶液沖提，尤以約95%醇類溶液為更佳。
    根據本發明，其中用以沖提的醇類溶液可為甲醇、乙醇。根據本發明之具體實施例，尤以乙醇溶液為佳。
    本發明亦提供另一種製備富含抗關節炎活性的到手香精萃物之方法，其包含將到手香植株或乾燥藥材，經溶劑萃取粗萃物，再將該粗萃物進行正相層析，先以己烷沖提，續以己烷/乙酸乙酯沖提分離出富含抗關節炎活性的精萃物。根據本發明具體實施例中，己烷/乙酸乙酯溶液中己烷與乙酸乙酯之比例為1：1。
    根據本發明之具體實施例，其中再以乙酸乙酯、乙酸乙酯/甲醇、及/或甲醇為溶劑，沖提分離出富含抗關節炎活性的精萃物。
    根據本發明，萃取前該到手香可為任何形式之材料，包括但不限於新鮮植株或乾燥藥材。以粉末形式進行萃取效果尤佳。粗萃方法可以任何習知方法進行，例如，以溶劑萃取，包括但不限於以醇類溶液粗萃。根據本發明之一實施例，為使用約95%乙醇溶液粗萃。
    根據本發明之一具體實施例，可包含先以約95%乙醇溶液粗萃，合併粗萃液再以管柱層析法於70%~95%乙醇溶液下沖提分離出富含抗關節炎活性的精萃物。
    根據本發明之又一具體實施例，可包含先以約95%乙醇溶液粗萃，合併粗萃液再將該粗萃物進行正相層析，先以己烷沖提，續以己烷/乙酸乙酯沖提分離出富含抗關節炎活性的精萃物。
    根據本發明，另可搭配其他適當之濃縮、純化方法，例如乾燥濃縮、減壓濃縮、冷凍乾燥等進行萃取及純化。
    根據本發明，以本發明到手香精萃物進行針對關節炎大鼠之實驗模型進行驗證，發現本發明到手香精萃物富含抗關節炎之活性。因此，本發明同時提供一種預防或治療關節炎之組合物。
    本發明亦提供一種預防或治療關節炎之醫藥組合物，其包含治療有效量之本發明富含抗關節炎活性的精萃物，以及醫藥上可接受之載劑。
    根據本發明，於治療關節炎醫藥物組合物中本發明富含抗關節炎活性的精萃物之治療有效量為0.5-10公克/每日。
    根據本發明，該醫藥組合物是包含治療有效量之本發明富含抗關節炎活性的精萃物，取決於施用的模式及待治療的狀況，包括年齡、體重、症狀、治療效果、投藥路徑及治療時間。
    本說明書所使用的「載劑」或「醫藥上可接受之載劑」乙辭是指用於醫藥之稀釋劑、賦形劑或類似物，包括製藥業一般知識者所熟知者主。
    可以任何適合的路徑施用本發明之醫藥組合物，包括但不限於非經腸道或口服投藥。非經腸道投藥之醫藥組合物其形式包括溶液、懸浮液、乳液，及可在使用前刻溶解或懸浮於溶劑中之固體可注射組合物。可藉由溶解、懸浮或乳化一或多活性成分於稀釋劑中來製備該注射液。前述稀釋劑之實例為用於注射之蒸餾水、生理鹽水、植物油、醇類及其組合。又，該注射液可含有安定劑、助溶劑、懸浮劑、乳化劑、平滑劑、緩衝液、保存劑等。該等注射液係在最終製劑步驟中滅菌或以無菌程序製備。本發明之醫藥組合物亦可被製劑成無菌固體配製品，例如，藉由冷凍乾燥，並可在使用前刻滅菌或溶解於無菌可注射水或其他無菌稀釋劑。
    根據本發明，該醫藥組合物亦可經口投藥，其中該組合物可為固體或液體形式。固體組合物包括錠劑、丸劑、膠囊、分散性粉劑、顆粒及其類似物。口服組合物亦包括漱口藥及舌下片劑。膠囊包括硬膠囊及軟膠囊。在此類口服固體組合物中，一或多活性化合物可自行混合，或與稀釋劑、結合劑、散解劑、潤滑劑、安定劑、助溶劑混合，接著以習知方法製劑成配製品。當需要時，此等配製品可以塗佈劑塗佈，或可以二或多種塗佈層塗佈。另一方面，口服液體組合物包括醫藥上可接受之液態溶液、懸浮液、乳液、糖漿、藥酒，及類似物。在此類組合物中，一或多活性化合物可被溶解、懸浮或乳化在通用稀釋劑中(如純化水、乙醇或其等之混合物等等)。除了此類稀釋劑，前述組合物亦可含有潤濕劑、懸浮劑、乳化劑、甜味劑、調味劑、香料、保存劑及緩衝液及其類似物。
    在下列具體實施例中，本發明將被更特定地描述。值得注意的是，下列所述本發明之具體實施例僅係用於說明，並非為詳列或限縮本發明範圍至所揭露之特定形式。 製備實例製備實例1(50%~95%乙醇溶液沖提精萃物) 初步萃取：
    取需要量之到手香乾燥藥材粉末，加入95%乙醇溶液萃取；將過濾所得藥渣再以95%乙醇溶液進行第二次萃取，經過濾將兩次過濾液合併，進行減壓濃縮至剩下原濾液體積之約1/20，得萃取濃縮液準備進行管柱層析分離。 管柱層析：
    將所得萃取濃縮液進行管柱層析，層析樹脂為HP-20。將所得萃取濃縮液加入逆滲透(RO)水，混和均勻後導入管柱中進行層析，續以逆滲透水導入管柱沖提，收集沖出液。續以4倍管柱體積逆滲透水與95%乙醇(體積比1：1)之溶液導入管柱中沖提，收集沖出液，再進行減壓濃縮至少量，冷凍乾燥得一到手香精萃物，編號為ON-024，作為0%~50%乙醇溶液沖提對照組。
    續以4倍管柱體積95%乙醇溶液導入管柱沖提，收集沖出液，再進行減壓濃縮至乾燥得到手香進一步之精萃物，編號為ON-025，即50%~95%乙醇溶液沖提精萃物。
    再以乙酸乙酯(Ethyl Acetate,EA)導入管柱沖提，收集沖出液進行減壓濃縮至乾燥得到手香乙酸乙酯沖提萃取物。 製備實例2(50%~95%乙醇溶液沖提精萃物)
    依製備實例1之初步萃取步驟進行萃取得萃取濃縮液，準備進行管柱層析。 管柱層析：
    將所得萃取濃縮液進行管柱層析，層析樹脂為HP-20。將所得萃取濃縮液加入其逆滲透(RO)水，混和均勻後導入管柱中進行層析，續以逆滲透水導入管柱沖提，收集沖出液，為到手香水沖提萃取物。
    續以2倍管柱體積逆滲透水與95%乙醇(體積比1：1)之溶液導入管柱中沖提，收集沖出液減壓濃縮至少量，冷凍乾燥得到手香精萃物，編號為ON-022。
    續以2倍管柱體積95%乙醇溶液導入管柱沖提，收集沖出液減壓濃縮至乾燥得到手香進一步的精萃物，編號為ON-023，即50%~95%乙醇溶液沖提精萃物。
    再以乙酸乙酯(Ethyl Acetate,EA)導入管柱沖提，收集沖出液減壓濃縮至乾燥得到手香乙酸乙酯沖提萃取物。 製備實例3(70%~95%乙醇溶液沖提精萃物)
    依製備實例1之初步萃取步驟進行萃取得萃取濃縮液，準備進行管柱層析。 管柱層析：
    將所得萃取濃縮液進行管柱層析，層析樹脂為HP-20。將所得萃取濃縮液加入逆滲透(RO)水，混和均勻後導入管柱中進行層析，續以逆滲透水導入管柱沖提，收集沖出液。續以逆滲透水與95%乙醇(體積比3：7)之溶液導入管柱中沖提，收集沖出液再進行減壓濃縮至少量，冷凍乾燥得一到手香精萃物，編號為ON-065。
    續以95%乙醇溶液導入管柱沖提，收集沖出液，再進行減壓濃縮至乾燥得一到手香進一步精萃物，編號為ON-066，即70%~95%乙醇溶液沖提精萃物。
    再以乙酸乙酯(Ethyl Acetate,EA)導入管柱沖提，收集沖出液進行減壓濃縮至乾燥為到手香乙酸乙酯沖提萃取物。 製備實例4(正相層析精萃物) 初步萃取：
    取需要量之到手香乾燥藥材粉末，加入95%乙醇溶液萃取；將過濾所得藥渣再以95%乙醇溶液進行第二次萃取，經過濾將兩次過濾液合併，進行減壓濃縮至少量，得萃取濃縮液，加入矽膠(Silica Gel)，經減壓濃縮至乾燥得粗萃物，使該粗萃物均勻吸附在膠體上。 管柱層析：
    取與原取用藥材重量相同之矽膠，以己烷(Hexane)充填於管柱內，將所得吸附該粗萃物的膠體覆蓋在充填好的管柱內膠體上，己烷導入管柱沖提，收集沖出液進行減壓濃縮至乾燥得到手香精萃物，編號為ON-078。
    續以己烷/乙酸乙酯(EA)溶液(體積比1：1)導入管柱沖提，收集沖出液減壓濃縮至乾燥得到手香己烷/乙酸乙酯沖提萃取物，編號為ON-079。
    續以乙酸乙酯(EA)導入管柱沖提，收集沖出液減壓濃縮至乾燥得到手香進一步之精萃物，編號為ON-083。
    續以乙酸乙酯(EA)/甲醇(Methanol,MeOH)溶液(體積比1：1)導入管柱沖提，收集沖出液再減壓濃縮至乾燥得手香乙酸乙酯/甲醇沖提萃取物，編號為ON-084。
    續以甲醇(MeOH)導入管柱沖提，收集沖出液再以減壓濃縮至乾燥得手香進一步甲醇沖提萃取物，編號為ON-085。 製備實例5(正相層析精萃物)
    依製備實例4之萃取步驟進行萃取得粗萃物，並使該粗萃物均勻吸附在膠體上，準備進行管柱層析。 管柱層析：
    取與原取用藥材重量相同之矽膠，以己烷(Hexane)充填於管柱內，將所得吸附該粗萃物的膠體覆蓋在充填好的管柱內膠體上，己烷導入管柱沖提，收集沖出液減壓濃縮至乾燥得到手香萃取物，編號為ON-078。
    續以2倍管柱體積己烷/乙酸乙酯(EA)溶液(體積比1：1)導入管柱沖提2倍之管柱體積，收集沖出液以減壓濃縮至乾燥得到手香己烷/乙酸乙酯沖提萃取物，編號為ON-080。
    續以4倍管柱體積己烷/乙酸乙酯(EA)溶液(體積比1：1)導入管柱沖提，收集沖出液減壓濃縮至乾燥得到手香己烷/乙酸乙酯沖提萃取物，編號為ON-092。
    續以乙酸乙酯(EA)導入管柱沖提，收集沖出液減壓濃縮至乾燥得到手香進一步之精萃物，編號為ON-083。 製備實例6(正相層析精萃物)
    依製備實例4之萃取步驟進行萃取得粗萃物，並使該粗萃物均勻吸附在膠體上，準備進行管柱層析。 管柱層析：
    取與原取用藥材重量相同之矽膠，以己烷(Hexane)充填於管柱內，將所得吸附該粗萃物的膠體覆蓋在充填好的管柱內膠體上，己烷導入管柱沖提，收集沖出液進行減壓濃縮至乾燥得到手香精萃物，編號為ON-078。
    續以2倍管柱體積己烷/乙酸乙酯(EA)溶液(體積比1：1)導入管柱沖提，收集沖出液再減壓濃縮至乾得到手香己烷/乙酸乙酯沖提萃取物，編號為ON-080。
    續以2倍管柱體積己烷/乙酸乙酯(EA)溶液(體積比1：1)導入管柱沖提，收集沖出液減壓濃縮至乾燥得一到手香己烷/乙酸乙酯沖提萃取物，編號為ON-081。
    續以2倍管柱體積己烷/乙酸乙酯(EA)溶液(體積比1：1)導入管柱沖提，收集沖出液導入管柱沖提，收集沖出液減壓濃縮至乾得到手香進一步之精萃物，編號為ON-082。
    續以乙酸乙酯(EA)導入管柱沖提，收集沖出液減壓濃縮至乾燥得到手香進一步之精萃物，編號為ON-083。
    續以乙酸乙酯(EA)/甲醇(Methanol,MeOH)溶液(體積比1：1)導入管柱沖提，收集沖出液減壓濃縮至乾燥得到手香乙酸乙酯/甲醇沖提萃取物，編號為ON-084。
    續以甲醇(MeOH)導入管柱沖提，收集沖出液減壓濃縮至乾燥得一到手香精萃物，編號為ON-085。 製備實例7(正相層析精萃物)
    依製備實例4之萃取步驟進行萃取得粗萃物，並使該粗萃物均勻吸附在膠體上，準備進行管柱層析。 管柱層析：
    取與原取用藥材重量相同之矽膠，以己烷(Hexane)充填於管柱內，將所得吸附該粗萃物的膠體覆蓋在充填好的管柱內膠體上，己烷導入管柱沖提，收集沖出液進行減壓濃縮至乾燥得到手香精萃物，編號為ON-078。
    續以己烷/乙酸乙酯(EA)溶液(體積比9：1)導入管柱沖提，收集沖出液再減壓濃縮至乾得到手香己烷/乙酸乙酯沖提萃取物，編號為ON-086。 製備實例8(正相層析精萃物)
    依製備實例4之萃取步驟進行萃取得粗萃物，並使該粗萃物均勻吸附在膠體上，準備進行管柱層析。 管柱層析：
    取與原取用藥材重量相同之矽膠，以己烷(Hexane)充填於管柱內，將所得吸附該粗萃物的膠體覆蓋在充填好的管柱內膠體上，，己烷導入管柱沖提，收集沖出液進行減壓濃縮至乾燥得到手香精萃物，編號為ON-078。
    續以己烷/乙酸乙酯(EA)溶液(體積比8：2)導入管柱沖提，收集沖出液再減壓濃縮至乾得到手香己烷/乙酸乙酯沖提萃取物，編號為ON-087。
    續以己烷/乙酸乙酯(EA)溶液(體積比1：1)導入管柱沖提，收集沖出液減壓濃縮至乾燥得到手香進一步之精萃物，編號為ON-088。 製備實例9(正相層析精萃物)
    依製備實例4之萃取步驟進行萃取得粗萃物，並使該粗萃物均勻吸附在膠體上，準備進行管柱層析。 管柱層析：
    取與原取用藥材重量相同之矽膠，以己烷(Hexane)充填於管柱內，將所得吸附該粗萃物的膠體覆蓋在充填好的管柱內膠體上，己烷導入管柱沖提，收集沖出液進行減壓濃縮至乾燥得到手香精萃物，編號為ON-078。
    續以己烷/乙酸乙酯(EA)溶液(體積比7：3)導入管柱沖提，收集沖出液減壓濃縮至乾燥得到手香己烷/乙酸乙酯沖提萃取物，編號為ON-089。
    續以己烷/乙酸乙酯(EA)溶液(體積比1：1)導入管柱沖提，收集沖出液減壓濃縮至乾燥得到手香進一步精萃物，編號為ON-090。 製備實例10(正相層析精萃物)
    依製備實例4之萃取步驟進行萃取得粗萃物，並使該粗萃物均勻吸附在膠體上，準備進行管柱層析。 管柱層析：
    取與原取用藥材重量相同之矽膠，以己烷(Hexane)充填於管柱內，將所得吸附該粗萃物的膠體覆蓋在充填好的管柱內膠體上，己烷導入管柱沖提，收集沖出液進行減壓濃縮至乾燥得到手香精萃物，編號為ON-078。
    續以己烷/乙酸乙酯(EA)溶液(體積比6：4)導入管柱沖提，收集沖出液再減壓濃縮至乾得到手香己烷/乙酸乙酯沖提萃取物，編號為ON-091。
    分別針對ON-024(0%~50%乙醇溶液沖提精萃物)、ON-025(50%~95%乙醇溶液沖提精萃物)、ON-066(70%~95%乙醇溶液沖提精萃物)及ON-080(正相層析精萃物)進行HPLC分析，於200 nm及320 nm波長檢測，發現ON-024的HPLC圖與本發明精萃物ON-025(50%~95%乙醇溶液沖提精萃物)、ON-066(70%~95%乙醇溶液沖提精萃物)及ON-080(正相層析精萃物)不同：
    (1) ON-024的HPLC圖，於200 nm波長檢測在滯留時間13、20、21、27、37、39分鐘有6個吸收峰(圖1)；ON-024的HPLC圖，於320 nm波長檢測在滯留時間13分鐘有咖啡酸(Caffeic acid)吸收峰；27分鐘有迷迭香酸(Rosmarinic acid)吸收峰；35分鐘有吸收峰(圖2)。
    (2) ON-025的HPLC圖，於200 nm波長檢測在滯留時間45分鐘有吸收峰；55分鐘有香芹酚(Carvacrol)吸收峰(圖3)；ON-025的HPLC圖，於320 nm波長檢測在滯留時間39-43分鐘有8個吸收峰；45分鐘有薊黃素(Cirsmaritin)吸收峰(圖4)。
    (3) ON-066的HPLC圖，於200 nm波長檢測在滯留時間45分鐘有薊黃素(Cirsmaritin)吸收峰；55分鐘有香芹酚(Carvacrol)吸收峰(圖5)；ON-066的HPLC圖，於320 nm波長檢測在滯留時間45分鐘有薊黃素(Cirsmaritin)吸收峰；62分鐘有三裂鼠尾草素(Salvigenin)吸收峰(圖6)。
    (4) ON-080的HPLC圖，於200 nm波長檢測在滯留時間55分鐘有香芹酚(Carvacrol)吸收峰(圖7)；ON-080的HPLC圖，於320 nm波長檢測在滯留時間18-21分鐘有3個吸收峰；37-41分鐘有3個吸收峰；43-45分鐘有2個吸收峰；45分鐘有薊黃素(Cirsmaritin)吸收峰；50-54分鐘有4個吸收峰；62分鐘有三裂鼠尾草素(Salvigenin)吸收峰(圖8)。 功效實例功效實例1 1.　以完全Freund’s佐劑(CFA)引發關節炎(arthritis)動物模式實驗
    將每組6隻重量170±10克的雌性Lewis大鼠進行動物實驗。完全Freund’s佐劑(CFA)，其為0.3 mg之殺死結丁酸核分枝桿菌(Mycobacterium butyricum)溶於0.1 mL植物油之均勻分散液，將CFA以單一劑量注射於大鼠右後腳掌副蹠部位(定為第1天)，注射後1小時再分別以載劑(1%羧甲基纖維素(carboxymethylcellulose),10 mL/kg)即對照組，或本發明萃取物以500 mg/kg劑量灌食(PO)方式給予實驗動物服用，每天2次連續5天(bid x 5)。於第0天(CFA處理前)及第14、18及21天以體積量測器(plethysmometer)量測每隻動物的左後腳掌體積，每一處理組動物與載劑處理對照組相比計算腫脹程度(net swelling)，以抑制百分比(inhibition %)表示。如相對於載劑處理對照組，處理之萃取物抑制腳掌體積腫脹達30%或以上者，表示其具顯著的抗關節炎活性。 將經上述處理之實驗老鼠，分別依下表所載劑量餵食本發明精萃取物500mg/kg，所得結果如下：
    由表1結果可知，本發明精萃物富含抗關節炎活性，尤其精萃物樣品ON-023,ON-025,ON-066及ON-080具顯著之抗關節炎活性。 2.　抗發炎活性實驗 (A)細胞培養
    自健康成人捐贈者之血液，以Ficoll-Paque(FP)梯度分離器分離得週邊血液單核細胞(PBMCs)。該血液加以稀釋置於Ficoll-Paque(FP)梯度分離器(Amersham Biosciences)頂部，室溫下以600 g離心30分鐘。分離出含PBMC相並以磷酸緩衝食鹽水加以清洗細胞。隨之將該等細胞重新懸浮於含10%熱去活性之胎牛血清(FCS)並種植於96-孔組織培養盤，每孔細胞密度為2.0 x 105細胞，供評估其抗發炎功效。 (B)本發明到手香精萃物與習知到手香萃取物對於PHA引發PBMC增生之抑制功效
    將人類PBMCs與最終濃度5μg/mL PHA以及各種形式之到手香萃取物(最終濃度0~90μg/mL)共同培養3天，PHA(5μg/mL)刺激前以Dexamethasone處理PBMCs，保留作為藥物正對照組。細胞培養物於37℃含5% CO2之濕潤大氣中培養3天，使用噻唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)分析PBMC增生效果。未以PHA處理之PBMCs做為負對照組。使用光電比色計在540nm波長下量測各孔內容物之吸光值。顏色強度會隨細胞增生程度成正比，因而可計算抑制活性而以IC50濃度表示。本實驗為三重複且數據以三重複之平均值±SEM表示。 (C)細胞激素之產生及測量
    3天培養後之最後一天，收集細胞懸浮液並分裝儲存於-20℃直到分析。在細胞懸浮液中產生腫瘤壞死因子TNF-α，細胞白介素IL-6,IFN-γ及IL-5的量依使用說明書指示以Quantikine ELISA kits(R&D Systems,Minneapolis,MN)測量。 結果 (A)各種萃取物對於PHA引發PBMCs增生之抑制作用
    使用PHA引發PBMCs增生技術平台檢測各種萃取物之抗發炎功效。各種方法所得之到手香萃取物均可依劑量反應抑制PHA引發淋巴白血球之增生。以含或不含到手香萃取物之MTT讀數(不含PHA)來評估待測物之細胞毒性。其中ON-023(40μg/mL)對PHA引發淋巴白血球之增生具完全的抑制活性，未見細胞毒性。相反的，ON-022(40μg/mL)對PHA引發淋巴白血球之增生僅具部分的抑制活性(~50%)。亦即，ON-023具有較ON-022高的抑制活性，且不具細胞毒性。 (B)各種萃取物對於PHA引發細胞激素產生之抑制作用
    自發性及PHA刺激細胞激素自PBMCs培養物中釋出之結果顯示於表2。而各種到手香萃取物對自人類PBMCs培養物PHA引發細胞激素釋出之作用如表3~表6所示，以及對PHA引發人類PBMCs增生之作用及IC50則顯示於表7及表8。由實驗結果可知到手香之萃取物具有抗發炎之效。




    圖1為ON-024的HPLC圖，於200 nm波長檢測在滯留時間13、20、21、27、37、39分鐘有6個吸收峰。
    圖2為ON-024的HPLC圖，於320 nm波長檢測在滯留時間13分鐘有咖啡酸(Caffeic acid)吸收峰；27分鐘有迷迭香酸(Rosmarinic acid)吸收峰；35分鐘有吸收峰。
    圖3為ON-025的HPLC圖，於200 nm波長檢測在滯留時間45分鐘有吸收峰；55分鐘有香芹酚(Carvacrol)吸收峰。
    圖4為ON-025的HPLC圖，於320 nm波長檢測在滯留時間39-43分鐘有8個吸收峰；45分鐘有薊黃素(Cirsmaritin)吸收峰。
    圖5為ON-066的HPLC圖，於200 nm波長檢測在滯留時間45分鐘有薊黃素(Cirsmaritin)吸收峰；55分鐘有香芹酚(Carvacrol)吸收峰。
    圖6為ON-066的HPLC圖，於320 nm波長檢測在滯留時間45分鐘有薊黃素(Cirsmaritin)吸收峰；62分鐘有三裂鼠尾草素(Salvigenin)吸收峰。
    圖7為ON-080的HPLC圖，於200 nm波長檢測在滯留時間55分鐘有香芹酚(Carvacrol)吸收峰。
    圖8為ON-080的HPLC圖，於320 nm波長檢測在滯留時間18-21分鐘有3個吸收峰；37-41分鐘有3個吸收峰；43-45分鐘有2個吸收峰；45分鐘有薊黃素(Cirsmaritin)吸收峰；50-54分鐘有4個吸收峰；62分鐘有三裂鼠尾草素(Salvigenin)吸收峰。
    权利要求:
    Claims (31)
    [1] 一種富含抗關節炎活性的到手香精萃物，其特徵在於其HPLC圖在320 nm波長檢測於45分鐘有薊黃素(Cirsmaritin)吸收峰。
    [2] 根據申請專利範圍第1項之到手香精萃物，其特徵在於以50%~95%醇類溶液沖提到手香粗萃物。
    [3] 根據申請專利範圍第2項之到手香精萃物，其特徵在於其HPLC圖於200 nm波長檢測在滯留時間45分鐘有吸收峰；55分鐘有香芹酚(Carvacrol)吸收峰，如圖3。
    [4] 根據申請專利範圍第3項之到手香精萃物，其特徵在於其HPLC圖於320 nm波長檢測在在滯留時間39-43分鐘有8個吸收峰；45分鐘有薊黃素(Cirsmaritin)吸收峰，如圖4。
    [5] 根據申請專利範圍第2項之到手香精萃物，其特徵在於以70%~95%醇類溶液沖提到手香粗萃物。
    [6] 根據申請專利範圍第5項之到手香精萃物，其特徵在於其HPLC圖於200 nm波長檢測在滯留時間45分鐘有薊黃素(Cirsmaritin)吸收峰；55分鐘有香芹酚(Carvacrol)吸收峰，如圖5。
    [7] 根據申請專利範圍第6項之到手香精萃物，其特徵在於其HPLC圖於320 nm波長檢測在滯留時間45分鐘有薊黃素(Cirsmaritin)吸收峰；62分鐘有三裂鼠尾草素(Salvigenin)吸收峰，如圖6。
    [8] 根據申請專利範圍第2項之到手香精萃物，其中該醇類溶液為乙醇溶液。
    [9] 根據申請專利範圍第5項之到手香精萃物，其中該醇類溶液為乙醇溶液。
    [10] 根據申請專利範圍第1項之到手香精萃物，其特徵在於以正相層析法製得，以己烷為溶劑分離出富含抗關節炎活性的精萃物。
    [11] 根據申請專利範圍第10項之到手香精萃物，其特徵在進一步以己烷/乙酸乙酯為溶劑分離。
    [12] 根據申請專利範圍第1項之到手香精萃物，其特徵在於以正相層析法製得，以己烷為溶劑之沖出液進一步以己烷/乙酸乙酯為溶劑沖出分離富含抗關節炎活性的精萃物。
    [13] 根據申請專利範圍第11項之到手香精萃物，其特徵在於其HPLC圖於200 nm波長檢測在滯留時間55分鐘有香芹酚(Carvacrol)吸收峰，如圖7。
    [14] 根據申請專利範圍第13項之到手香精萃物，其特徵在於其HPLC圖於320 nm波長檢測在滯留時間18-21分鐘有3個吸收峰；37-41分鐘有3個吸收峰；43-45分鐘有2個吸收峰；45分鐘有薊黃素(Cirsmaritin)吸收峰；50-54分鐘有4個吸收峰；62分鐘有三裂鼠尾草素(Salvigenin)吸收峰，如圖8。
    [15] 一種製備富含抗關節炎活性的到手香精萃物之方法，其包含下列步驟：將到手香植株或乾燥藥材，經溶劑萃取得粗萃物，再將該粗萃物以50%~95%醇類溶液層析沖提分離出富含抗關節炎活性的精萃物。
    [16] 根據申請專利範圍第15項之方法，其中以70%~95%醇類溶液層析沖提分離出富含抗關節炎活性的精萃物。
    [17] 根據申請專利範圍第16項之方法，其中以約95%醇類溶液層析沖提分離出富含抗關節炎活性的精萃物。。
    [18] 根據申請專利範圍第15至17項中任一項之方法，其中該醇類溶液為乙醇溶液。
    [19] 一種製備富含抗關節炎活性的到手香精萃物之方法，其包含下列步驟：將到手香植株或乾燥藥材，經溶劑萃取得粗萃物，再將該粗萃物以己烷為溶劑進行正相層析分離粗萃物，分離出富含抗關節炎活性的精萃物。
    [20] 根據申請專利範圍第19項之方法，其進一步以己烷/乙酸乙酯為溶劑進行正相層析分離出富含抗關節炎活性的精萃物。
    [21] 一種製備富含抗關節炎活性的到手香精萃物之方法，其包含下列步驟：將到手香植株或乾燥藥材，經溶劑萃取得粗萃物，再將該粗萃物以己烷為溶劑進行正相層析得一沖出液，該沖出液進一步以己烷/乙酸乙酯為溶劑沖出分離富含抗關節炎活性的精萃物。
    [22] 根據申請專利範圍第15、19或21項之方法，其中該到手香為新鮮植株或乾燥藥材。
    [23] 根據申請專利範圍第15、19或21項之方法，包含適當之濃縮、純化方法以進一步精萃。
    [24] 根據申請專利範圍第23項之方法，其中該純化方法係為一選自乾燥濃縮、減壓濃縮、冷凍乾燥管及管柱層析及其組合組成之群之方法。
    [25] 一種由申請專利範圍第15、19或21項之方法所製得之富含抗關節炎活性的到手香精萃物。
    [26] 一種預防或治療關節炎之組合物，其包含根據申請專利範圍第1至14項中任一項之富含抗關節炎活性的到手香精萃物。
    [27] 一種預防或治療關節炎之組合物，其包含根據申請專利範圍第15、19或21項之方法所製得之富含抗關節炎活性的到手香精萃物。
    [28] 一種預防或治療關節炎之醫藥組合物，其包含治療有效量之包含根據申請專利範圍第1至14項中任一項之富含抗關節炎活性的到手香精萃物以及一種醫藥上可接受之載劑。
    [29] 一種預防或治療關節炎之醫藥組合物，其包含治療有效量之根據申請專利範圍第15、19或21項之方法所製得之富含抗關節炎活性的到手香精萃物以及一種醫藥上可接受之載劑。
    [30] 一種治療發炎之組合物，其包含治療有效量之包含根據申請專利範圍第1至14項中任一項之富含抗關節炎活性的到手香精萃物。
    [31] 一種治療發炎之組合物，其包含根據申請專利範圍第15、19或21項之方法所製得之富含抗關節炎活性的到手香精萃物。
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